Identification of novel transcripts in annotated genomes using RNA-Seq

CuffLinks 논문중 하나. CuffLinks의 한 옵션인  -g 옵션의 설명을 위한 논문. RABT(reference annotation based transcript assembly)를 설명하는 논문이다.




INTRODUCTION
RNA-Seq의 탄생으로 좀 더 정교한 transcript abundance estimation이 가능해졌다. 그런데 그것 뿐만 아니라 RNA-Seq을 EST로 봄으로써 genome annotation도 가능함을 이야기 한다. 이런 RNA-Seq으로 annotation하는데 있어서 발현양이 적은 transcript의 경우에는 transcript의 부분만이 커버가 된다는 문제점이 있다. 아래 그림에서와 같이 95%이하로 cover된 transcript가 64.4%를 차지함을 볼 수있다. 이렇듯 naive assembly 방식으로는 제대로된 transcript를 구축하는데 문제가 있을 수 있다. 

기존의 transcript assembly를 아래 3가지로 나눌수 있는데 그 어떠한 방식도 기존의 annotation을 이용하지 않는다.

1. De novo assembly
2. Genome reference based transcript assembly : genome에다가 mapping 하고 assembly 한다. Scripture 프로그램에서 했던 것. cover된 영역 사이의 gap을 채우는 것. 하지만 기존에 존재하던 annotation 파일을 이용하지는 않았다는 한계점이 있단다.
3. RNA-Seq assisted protein coding gene annotation : ab initio gene finding program의 증거로다가 RNA-Seq데이터를 이용하는 것.

그래서 이 논문에서 기존의 annotation을 assembly에 이용하는 방식인 RABT assembly 방식을 소개한다.

METHODS

위 method를 이해하기 위해서는 먼저 cufflinks의 transcript assembly를 봐야한다.
Cufflinks Transcript Assembly
cufflinks의 transcript assembly는 다음과 같은 목적을 갖는다.

1. 모든 fragment(paired-read)는 최소 한개의 assembled transcript와 일치한다
2. 모든 transcript는 read들의 tiling에 의한 것이다
3. transcript의 갯수는 위의 목적 1번을 만족하게 하는 최소한의 transcript 수이다.
4. the resulting RNA-Seq models are identifiable

결국 fragment를 설명하기 위한 최소한의 갯수의 transcript를 찾아내는 것이 cufflinks의 목적.

reference annotation을 assembly algorithm에 이용하기 위해 3가지 접근을 채택했다(위의 그림이 overview).

1. reference transcript로 부터 가상으로 faux-read를 tiled 되게 만들어서 low coverage transcript의 missing 된 부분을 찾을 수 있도록 한다. reference transcript의 15bp마다 405bp 길이의 faux-read를 생성.
2. read와 1번 step의 faux-read 모두를 이용하여 Cufflinks로 parsimonious assembly를 한다. 
3. 2번 step에서 생긴 transfrag들을 reference transcript와 비교해서 다음 다섯가지 모든 조건과 일치하면 제거한다.
• 5' endpoint가 reference transcript에 포함된 경우
• 3' endpoint가 reference transcript의 600bp 이상으로 뻗지 못한 경우(그리고 이 영역에 intron이 없는 경우)
• reference transcript에 없는 intron을 가지지 않은 경우
• a
• a

RESULTS


DISCUSSION