Evaluation of Algorithm Performance in ChIP-Seq Peak Detection

제목 그대로 ChIP-Seq 프로그램 performance를 비교한 것인데.. 음 이런 논문이야 말로 짐 회사에서 내기 좋은 주제가 않을까 싶은데.. 아숩다.

ChIP-Seq 데이터 분석에서 필요한 peak finding을 위한 프로그램이 31개나 있단다. introduction에 보면 ChIP-Seq 분석 프로그램의 대략적인 알고리즘 개요가 나온다. NGS 특성상 5' 쪽의 tag만 읽기 때문에 생기는 strand-dependent bimodality를 보정하기 위한 방법(paired-end 는 몇개의 프로그램에서만 지원된단다), read가 많이 mapping된 genomic region을 찾는 방법, peak region을 찾기 위해 threshold를 정하는 방법(background signal model 이용:1.manual threshold,2.Poisson or negative binomial model 이용,3.control data 이용), peak의 significance를 정하는 방법에 대한 여러 알고리즘의 간략한 소개가 있다.

일단 여기서는 11개의 peak calling algorithm을 3개의 transcription factor ChIP-Seq 데이터를 가지고 비교한다. 이것이 이 논문의 목적.

Results
overview
3가지 dataset은 NRSF(human neuron-restrictive silencer factor), GABP(growth-associated binding protein), FoxA1(hepatocyte nuclear factor 3a)의 ChIP-Seq데이터. 
테스트한 프로그램들 11개의 리스트는 아래와 같고 각 프로그램의 option들은 default를 이용(control data를 이용할 수 있는 프로그램만 선택).

Sensitivity
3개의 dataset에 대해 11개의 program에서 찾는 peak의 수는 차이가 있다. 

Principle and challenges of genome-wide DNA methylation analysis

DNA methylation을 detecting 할 수 있는 실험적인 모든 것에 대해 대략적인 설명과 장단점을 나열한다. DNA methylation 실험 방법에 대해 전체적인 윤관을 잡고 싶다면 매우 유용한 논문. 설명이 필요 없다. 아래 표랑 그림만 봐도 정리가 잘 되어 있다. PCR 단계에서 methylation 정보를 잃기 때문에 기본적으로 PCR전의 treatment 하는데 이를 크게 3가지로 나눴고(enzyme digestion,affinity enrichment, bisulfite conversion) chip을 사용하느냐 sequencing을 하느냐에 따라 방법을 나눈다.

A Bayesian deconvolution strategy for immunoprecipitation-based DNA methylation analysis

BATMAN(Bayesian tool for methylation analysis) 라는 프로그램은 만든 논문. 그 계보가 MEDIPS 라는 프로그램으로 이어진다. 


이 논문 intro에서도 나온다 MeDIP은 absolute 한 methylation 정도를 판단하기에는 CpG density의 영향을 받는다고. 해서 자기네가 이러한 문제를 해결하고자 Batman을 만들었다고.


첨엔 MeDIP-chip 실험의 feature에 대해 살펴보고 이에 맞는 수식 설명힌다.

C_cp(coupling factor) 라는 것을 정의, 이는 probe p와 CpG dinucleotide c와의 값으로 probe p에 붙은 c를 포함한 DNA 조각의 fraction. 이건 어떠쓰는 용어 정의냐? 이건 probe의 CpG density 를 정의한 C_tot를 구할때 사용한다. C_tot의 정의가 곧 sum of Ccp. probe 주변에 CpG 가 가까이 그리고  많이 있다면 당연히 probe에 붙은 DNA 조각 중에 그 CpG를 갖는 조각들이 많을거고  또 그런식으로 probe에 CpG가 많다면 그 Ccp 값의 총 합이 높을 것이므로(아.. 설명이 참..안되네). 여튼 Ctot를 probe의 CpG density로 사용하였고 그래서 array signal과 그래프로 그려보니(아래 그림 b)..

CpG poor region이 methylation이 많이 되어 있고 CpG density가 높은 곳은 methylation이 안되어 있는걸로 보임. 그리고 CpG poor region에서 CpG density와 array signal이 linear 한 관계를 보인다고(아.. 난 왜 못느끼겟지..). 
그래서 이 signal이 methylated CpG에 의해서만 생긴다고 가정하면, 곧 signal 값은 methylation에 CpG density 만큼 weighted 한 값. 그러므로 array signal의 확률 분포를 표현하자면 아래와 같이 된다.

여기서 A는 array 결과, m은 methylation 상태, G(x|u,a²) 는 가우시안 확률밀도 함수(u는 평균을 a는 표준 편차 의미..) 라고 표현이 되고 결국 우리가 얻어야 하는 값은 f(m|A). 이는 Bayesian inference를 통해서 구한다(이거 고딩때 배운거, 근데 이상하게 어렵게 느껴지긴 한다).

컴퓨터 파워를 낮추기 위해 각 CpG 를 모델링 하기보다는 이를 50- 또는 100 bp로 묶어서 그 안에 들어가 있는 CpG는 같은 level의 methylation level이라고 가정. 그러고 나서 inference를 위해 nested sampling을 사용했다는데.. 원.. 뭔소린지 모르겠다(여기 참조, 사실 이게 bioinformatics를 한다고 하는 나의 가장 큰 약점이다.사실 이 때문에 창피해서 bioinfo한다고 잘 이야기 못하는 듯).

다음은 MeDIP-Seq 에 대한 feature 설명과 BATMAN을 통한 분석 에 대한 설명. 일단은 MeDIP-Seq을 하고 read 만들어서 Maq으로 genome에 mapping하고 보니

위 그림 a와 같이 low mapping quality를 갖는 window가 보이더라(내가 이해하기론 Maqs의 mapping quality가 10 이상인 read mapping 만 이용했는데, genome을 50 kb로 window를 만들어서 각 window별로 read에 의해 얼마나 커버 됐는지에 따라 frequency를  그림으로 표현했을때). 이런 것이 알고 보니 duplication/structural variation이더라. 그래서 이런 부분은 mask 하고 분석했다. 두번째 그림은 read 양별로 얼마나 methylation 부위를 커버하는지. 보면 특정 read 수가 넘어가면 뭐 cover 하는 양이 크게 변화가 없는걸로 보인다.

BATMAN으로 MeDIP-Seq을 분석할려면 두가지에서 변형이 필요한다. 1.linear 모델대신 2차의 polynomial model 사용.2.Gaussian error model 대신 rectified Gaussian model 사용. 100bp resolution으로 결과를 뽑아 냈단다. 그리고 repeat이 있는 부위의 methylation은 under-estimate 될거란 생각에 버린다.

Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology

intro에서는 DNA methylation 실험 방법 종류 설명. MeDIP이랑 MBD¹. MeDIP의 경우 antibody를 이용하고 MBD는 Methyl-Binding Domain protein인 MECP2²를 사용. 논문에 따르면 MBD-seq은 MeDIP-seq 보다는 최근에 시작 됐다고 하네. 그담에 BS-Seq에 대한 이야기가 나온다. 아직(그러니까 그당시 2010 4월) 까진 whole genome BS-Seq이 Arabidopsis 랑 human의  밖에 없단다.
아.. 이 논문 YH(Yan Huang) methylome project 의 시작 논문인갑다(관련 기사). 이게 PBMCs(peripheral blood mononuclear cells) 의 methylome을 base resolution으로다가 밝히는 작업인데.. 이미 YH project에서 genome 을 sequencing 했기에 bisulfite 처리된 read를 mapping 할 때 자신의 genome sequence에다가 mapping 하기 때문에 accuracy가 높다. 또한 ASM(allele specific methylome)이 ASE(allele specific expression)이랑 연관이 깊더라 이런 점도 밝혔단다.


여튼 이 논문의 목적이 뭐냐. 이 논문이 publish 됐을 때 BS-Seq 데이터는 이미 plos biology에 논문이 나갈 준비가 되고 있었던거 같고(in press라고 표현 된걸로 보아), 이 논문에서는 그 BS-Seq 데이터를 reference로 해서 MeDIP-Seq과 MBD-Seq을 비교해 본다.


결론을 이야기 하자면 일단 여기는 프로그램을 MACS을 써서 methylated region을 찾았는데, MBD-Seq은 highly methylated, high-CpG density region에 sensitive 하고 MeDIP은 highly methylated, intermediated-CpG density regions에 sensitive 하다는 것. 아... 그런데 결정적인 말이 있다. BS-Seq 분석결과 대부분의 highly methylated regulatory region은 low-CpG density 이므로 이런거 분석 할려면 MeDIP이 났단다. 아 근데.. 뭐지.. 실험적인 측면에서 이야기 한게 있는데 NaCl 농도를 600mM 로 하면 MBD-Seq도 low-CpG에 sensitive 하단다(salt 농도에 따른 protein의 활성에 따른건가? 이건.. 자세히 봐야 알겠다). 
아래 그림이 두 방법을 비교한 그림

그리고 두 방법 다 read density가 methylation 정도를 정확히 표한하진 못했다고.. 이 사실은 이미 알려져 있었던거고 CpG density에 read density와 correlation이 있다는것. 그래서 CpG density에 연관된 biased를 교정하는 step이 절대적으로 필요하단다. MBD-Seq의 경우 high- MeDIP의 경우 intermediate- CpG density에 대한 교정이 필요. 이 교정 방법으로 소개한게 Bayesian strategy(이 논문 꼭 봐야 겠다). 


결론은 두 방법을 섞어서 사용하는게 좋을거 같다는거고 그래도 BS-Seq을 대체하지 못하고 특히나 bias 때문에 absolute 한 값을 사용하는건 좋은 생각이 아니라는 것. 다만 두 sample을 비교 할때는 어짜피 둘다 bias가 들어가 있으니 relative 한 값을 비교할때는 괜찮을 것이라는 것.

------------------------reference-----------------------------
1.MBD-Seq :
2.MECP2 :
2.BS-Seq :