Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic difference

전에 포스팅한 논문에서 quality assessment에서 이번 논문의 방식을 따랐는데.. incomplete bisulfite conversion에 의한 putative non-CpG methylation을 구별하고자 binomial test랑 false discovery rate를 이용했는데.. 이거 또 봐야하지 않겠나해서 본다.

abstract를 보자면 처음으로 single-base resolution DNA methylation을 본 논문이란다. 동시에 mRNA, small RNA, histone modification, DNA-protein interaction도 봤단다. 돈 많이 썻다. 두개의 genome(human embryonic stem cell, IMR90 fetal lung fibroblast)의 methylation을 비교했는데 stem cell의 경우 methylation의 1/4 가량이 non-CpG 에서 나타났단다. 엄청나다. 그래서 이것이 아마도 stem cell에서는 완전 다른 methylation mechanism이 있는게 아닐까 한단다. 재밌는건 non-CpG methylation이 gene body 부분에 enrichment되어 있고 protein binding site과 enhancer에는 depletion 되어 있다는 것. 더욱 재미있는건 이와 같은 non-CpG methylation이 differentiation 되면서 잃어가는 반면 induced pluripotent stem cells에서 다시 나타난다는 것.

내용이 재밌어 보이기는 하지만 시간 관계상 일단은 내가 보고자 하는 것만 본다. supplementary information을 보자. 


Data Analysis에 보면 처음에 read의 3단계의 preprocessing 과정과 또 3단계의 post-processing 과정이 나온다. 이건 패스 하고.. 


Identification of methylated cytosines를 보면 내가 찾고자 했던 binomial test에 대해 나온다. 일단은 binomial test¹ 에 대한 기본적인 내용은 아래 reference를 참조하고.. 이 논문에서는 unmethylated lambda genome을 spiked(이거 직역이 뭔지 모르겠네) 했는데, 이 lambda genome에 align 되는 read를 가지고 error rate(그러니까 unmethylated genome을 BS-Seq 했으니까 read들의 모든 cytosine이 T로 변환되어 있어야 정상인데 그렇지 않은 cytosine 을 전체 cytosine의 갯수로 나누어서 error rate을 구함)를 구하고 이를 binomial distribution B(n,p)의 확률 p로 사용한다. 그리고 n은 각 cytosine position에서의 read depth. 음 여기서 확실하게 이해가 안되는 부분이 있는데.. 여기 표현을 빌리자면 0.01 FDR corrected P-value를 이용해서 methylation 의 threshold를 구하고 methylation 됐다 안됐다를 따지는데..


다시 말하면 B(n,p) n은 각 cytosine position에서의 read depth, p는 위의 error rate. 한 cytosine position에서 cytosine 이라고 sequencing 된 read(k; cytosine이라고 나왔다는 건 conversion이 안됐다는 거고 곧 methylated cytosine을 의미) 의 p-value가 M보다 작아야 하는데 M은 M*(number of unmethylated cytosines) < 0.01*(number of methylated cytosines) 를 만족하는 수. 내가 이해하기로 곧 p-value가 0.01*(# of methylated cytosines)/(# of unmethylated cytosines) 보다 작아야 이를 methylated 됐다고 판단 한다는 것. 이해가 안가는게 바로 이점. 여기서 0.01을 곱했다고 해서 0.01 FDR corrected P-value라고 표현한 것 같은데 이게 이해가 안된다.. 아.. 


아니면 내가 전혀 딴소리 하고 있는건가..




--------------------------------------reference------------------------------------------
1.binomial test : 일단은 두개의 category가 일어날 확률이 비슷하다는 것이 귀무가설일때 사용하는 test 란다. 예를 보자. 주사위를 이용한 보드 게임을 한다고 할때, 235번 주사위를 던져서 51번 6이 나왔을때 과연 이 주사위가 제대로 된거냐(fair dice)? binomial test를 이용해서 이 문제를 해결하기 위해 이항분포 B(235,1/6)을 이용한다. 이 이항분포에서 6이 52 번 이상이 나올 확률을 더한다. 그니까 이항 분포니까 평균이 np 분산이 npq, 곧 235*1/6=39 가 평균, 235*1/6*5/6 이 분산인 정규 분포를 따르게 되고 one-tailed test로 하자면 51을 이상에서의 확률 밀도 함수의 면적이 0.026544 가 나오니까 이는 상당히 significant 하다.. 뭐 이런.. 

Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq

아래 포스팅은 MBD-Seq 중에 MiGS. 이건 MethylCap-Seq. 차이점이 정확히 무엇인지 알기 위해 본다. 특히나 중요한 것중에 하나가 elution시 salt 농도를 gradient를 줘서 elution 하는거 같은데 확실히 알아볼 필요가 있다.

Dynamic changes in the human methylome during differentiation

바로 아래 포스팅도 급하게 method만 봤는데.. DMR을 찾을때의 방법을 정확하게 모르겠어서 다른 논문에서는 어떻게 하는게 찾다가 나온 논문. 생물학적인 의미는 읽지 않은채 거의 method 위주로 읽고 있는데.. 아.. 어쩔수 없다. 다음주 수요일 보건원 발표 때까지 분석 방향을 잡아야 해서.. 어짜피 나중에 다 보게 될거다. 그 때 그때 포스팅 수정하기로 한다.

The DNA Methylome of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

예전에 포스팅 했던 논문의 reference 데이터로 사용되었던 BS-Seq 데이터에 대한 논문.

YH project로 아시아 최소 genome sequencing 한 사람의 PBMC(peripheral blood mononuclear cells)의 whole genome BS-Seq을 한 논문으로 CpG methylation pattern과 ASM(allele-specific methylation), ASE(allele-specific expression)에 대해서 조사하였다.

Results

<Data Generation and Quality Assessment>

103.5Gbp paired-end 데이터 생성, 그중 70.4Gbp (68%) 가 genome에 align됨. 2.21Gb genome (haploid part만 고려) 에서 18,962,679 CpG 사이트가 있는데 그중 한쪽 strand 이상 커버한 것이 99.86%, 양쪽 strand 모두 커버한 것이 92.62% (quality score가 14이상인 것들만 고려). 아 그리고 정말 궁금했던 것이 여기서 나오는데.. 어떻게 ASM이라는 걸 detecting 하는걸까 궁금했는데. 

Materials and Methods

<Sample Preparation and Bisulfite Sequencine>
DNA methylation의 strand specificity 때문에 Watson and Crick strand를 합쳐서 6Gbp의 reference를 만들고("original form") C을 T으로 변환한다("alignment form"). read들 역시 conversion 하는데 read가 paired-end 이기 때문에  1.forward read의 cytosine을 thymine으로 변환, 2.reverse read는 G를 A로 변환. 이 변환된 read를 변환된 reference("alignment form")에 align 한다.

unambiguous alignment : 허용 범위 안의 mismatch로 unique alignment된 hit.

Local copy number of a genomic location : 특정 genomic location에 align 된 read의 hit count를 평균한 값. 이때 read는 ambiguous read도 사용. 그러니까 특정 영역의 genome에 align된 read들이 unique mapped된것 뿐만 아니라 ambiguously aligned read도 있으니까 각 read마다 게놈상에 align hit들이 있을텐데 이를 평균한 값. 이게 높다면 redundant alignment가 많다는거고 이 genome 영역은 분석에 사용하기에 적합하지 않다고 판단(이 기준이 1.5). 이 1.5 안넘는 genome의 영역이 2.21Gbp.

potentially methylated site : reference랑 read를 alignment하고 난뒤 "alignment form" 에서 "original form"으로 변환했을때 둘 다 C인 site.

<Estimation of Methylation Level>
methylation의 ascertainment가 sequencing error에 의한 것일수도 있기 때문에 이를 방지 하기 위한 quality threshold를 정해야 하는데 >14 이상이 되니까 non-CpG site의 methylation level이 변화가 없더라. methylation level은 이 >14 이상 read중에 ascertainment read의 percentage.


<Identification of Potential Tissue-Specific Differentially Methylated Regions (tDMR)>

최소 5개 이상의 CpG site를 포함하는 window중 2-fold change 이상의 methylation 차이가 있거나 fisher test p-value가 <1e-20 인 window들을 tDMR이라고 한다. 두 tDMR이 인접해 있을때 ...


<Identification of Haploid Differentially Methylated Regions (hDMR)>

tDMR과 pvalue만 <0.001 이라는 점만 제외하고 같다. 인접한 hDMR은 ...

------------------알아야 할 점----------------------

1.region의 uniqueness를 알기 위해 local copy number를 계산할 때 region영역을 얼마로 잡았는지.

2.FP 공식 이해.

3.coverage depth에서 "could provide 5 different results"의 의미

4.tDMR, hDMR에서 2 fold 만 보는건지 그 이상을 보는건지.

5.tDMR, hDMR의 인접한 DMR을 join하는 기준이 정확히 무엇인지.

DNA methylation review 논문

이전 포스팅 보다 아래의 논문이 읽기에 더 났다. 이전 포스팅은 표가 정리가 잘되어 있고..
다음 논문은 실험적인 내용이 좀더 디테일하게 설명되어 있고.. 다음 논문은 실험에 대한 그림이 젤 났다.

Principle and challenges of genome-wide DNA methylation analysis

DNA methylation을 detecting 할 수 있는 실험적인 모든 것에 대해 대략적인 설명과 장단점을 나열한다. DNA methylation 실험 방법에 대해 전체적인 윤관을 잡고 싶다면 매우 유용한 논문. 설명이 필요 없다. 아래 표랑 그림만 봐도 정리가 잘 되어 있다. PCR 단계에서 methylation 정보를 잃기 때문에 기본적으로 PCR전의 treatment 하는데 이를 크게 3가지로 나눴고(enzyme digestion,affinity enrichment, bisulfite conversion) chip을 사용하느냐 sequencing을 하느냐에 따라 방법을 나눈다.

Computational analysis of genome-wide DNA methylation during the differentiation of human embryonic stem cells along the endodermal lineage

MEDIPS 라는 MeDIP-Seq 분석 프로그램을 개발한 논문이다.
이 논문에서는 MEDIPS 프로그램을 개발했고 이를 다른 기존의 프로그램과 비교한다. 또 실질적인 실험 데이터에 잘 맞는지 확인하기 위해 hESC(human Embryonic Stem Cell) 에서 definitive endoderm으로의 분화과정에서의 methylation 변화에 대한 실험에 MEDIPS 프로그램을 적용한다. 뿐만 아니라 histone modification, TF binding site 데이터와 같이 분석하여 demethylation이 low CpG density 지역과 연관이 있음을 밝혀 냈다.

intro에서는 MeDIP과 BS-Seq, 그리고 RRBS에 대해서 이야기 하면서 MeDIP이 싸니까 쓰기 좋다라는 식으로 이야기 한다. 그리고 이러한 MeDIP-seq 분석을 위한 제대로 된 툴이 없다(물론 BATMAN과 MEDME를 예로 들긴하지만)면서 computational time, MeDIP-seq 실험 디자인을 위한 important feature가 아직 address 되지 않았다는 문제(quality control metrics, identification of differential methylation), sufficient read count, analysis of the enrichment of CpG-rich reads 등의 문제를 제기한다.

뭐 결국 BATMAN의 coupling factor의 개념을 사용하는데, 자기네가 훨씬 빠르고 정확하단다. 아.. 이거 R package란다.

coupling factor를 계산하기 위한 distance function을 바탕으로 해서 low range coupling factor에서의 CpG density와 signal의 dependency를 측정한다. 그 BATMAN과의 차이는 BATMAN은 이 값을 Bayesian deconvolution process에 이용하는데 반해 MEDIPS 는 그냥 signal 값을 이 dependency로 weight 를 가한다(요부분은 사실 BATMAN의 과정을 정확히 이해하지 못했기에 잘 모르겠다). 아래 그림이 normalizaion 전/후의 MeDIP-Seq 데이터와 bisulfite 데이터와 비교 그림

그림에서 보듯이 BATMAN과 MEDIPS 모두 normalization후 bisulfite 데이터와 correlation이 높아짐.

Epigenetic Predictor of Age

어제 plos one에 epigenetic predictor of age 란 제목으로 논문이 나왔다. 제목에서 느낄수 있듯이 DNA methylation pattern으로 나이를 예측할 수 있다는 내용의 논문이다. 재밌지 않은가? 물론 여느 연구자들은 당연한거 아닌가란 반응을 할테지만(내가 만나본 대부분의 researcher들은 남들이 뭔가를 발표하면 거 뭐 당연한거 아닌가라는 반응을 많이 한다) methylation pattern과 나이에 상관관계가 있다는 사실을 증명한건데. 논문 보기 전에 생각을 해보면.. 그렇다면 노화랑 methylation이랑 연관이 있다는 거고.. 좀더 과장되서 생각해보면 나이든 사람이 보통 cancer와 같은 complex disease에 많이 걸리는데 어떻게 보면 methylation이 이와 같은 것에 연관이 있는게 아닌가(이 역시 물론이지만). 여튼 왠지 흥미를 유발하는 논문이다.
abstract를 보면.. 
21살에서 55살까지의 34쌍의 남자 일란성 쌍둥이의 침에서 부터 나이와 correlation이 높은 80여개의 유전자의 내부나 근처의 88개의 methylation site를 찾았다. 이 중 3개의 유전자의 promoter 부위의 methylation pattern을 다른 샘플을 통해 validation 했다. 이들 loci에서부터 단 2개의 cytosine을 가지고 regression model을 만들고 나이를 예측했는데 나름 잘 맞나보다(생각보다 완전 정확한거 같진 않다). 이들은 이를 법의학에서 사용될 수있고 의학적으로 겉으로 보이는 나이가 아니라 실제 신체나이로 이를 사용할 수 있지 않나라고 마무리를 짓는다.

A Bayesian deconvolution strategy for immunoprecipitation-based DNA methylation analysis

BATMAN(Bayesian tool for methylation analysis) 라는 프로그램은 만든 논문. 그 계보가 MEDIPS 라는 프로그램으로 이어진다. 


이 논문 intro에서도 나온다 MeDIP은 absolute 한 methylation 정도를 판단하기에는 CpG density의 영향을 받는다고. 해서 자기네가 이러한 문제를 해결하고자 Batman을 만들었다고.


첨엔 MeDIP-chip 실험의 feature에 대해 살펴보고 이에 맞는 수식 설명힌다.

C_cp(coupling factor) 라는 것을 정의, 이는 probe p와 CpG dinucleotide c와의 값으로 probe p에 붙은 c를 포함한 DNA 조각의 fraction. 이건 어떠쓰는 용어 정의냐? 이건 probe의 CpG density 를 정의한 C_tot를 구할때 사용한다. C_tot의 정의가 곧 sum of Ccp. probe 주변에 CpG 가 가까이 그리고  많이 있다면 당연히 probe에 붙은 DNA 조각 중에 그 CpG를 갖는 조각들이 많을거고  또 그런식으로 probe에 CpG가 많다면 그 Ccp 값의 총 합이 높을 것이므로(아.. 설명이 참..안되네). 여튼 Ctot를 probe의 CpG density로 사용하였고 그래서 array signal과 그래프로 그려보니(아래 그림 b)..

CpG poor region이 methylation이 많이 되어 있고 CpG density가 높은 곳은 methylation이 안되어 있는걸로 보임. 그리고 CpG poor region에서 CpG density와 array signal이 linear 한 관계를 보인다고(아.. 난 왜 못느끼겟지..). 
그래서 이 signal이 methylated CpG에 의해서만 생긴다고 가정하면, 곧 signal 값은 methylation에 CpG density 만큼 weighted 한 값. 그러므로 array signal의 확률 분포를 표현하자면 아래와 같이 된다.

여기서 A는 array 결과, m은 methylation 상태, G(x|u,a²) 는 가우시안 확률밀도 함수(u는 평균을 a는 표준 편차 의미..) 라고 표현이 되고 결국 우리가 얻어야 하는 값은 f(m|A). 이는 Bayesian inference를 통해서 구한다(이거 고딩때 배운거, 근데 이상하게 어렵게 느껴지긴 한다).

컴퓨터 파워를 낮추기 위해 각 CpG 를 모델링 하기보다는 이를 50- 또는 100 bp로 묶어서 그 안에 들어가 있는 CpG는 같은 level의 methylation level이라고 가정. 그러고 나서 inference를 위해 nested sampling을 사용했다는데.. 원.. 뭔소린지 모르겠다(여기 참조, 사실 이게 bioinformatics를 한다고 하는 나의 가장 큰 약점이다.사실 이 때문에 창피해서 bioinfo한다고 잘 이야기 못하는 듯).

다음은 MeDIP-Seq 에 대한 feature 설명과 BATMAN을 통한 분석 에 대한 설명. 일단은 MeDIP-Seq을 하고 read 만들어서 Maq으로 genome에 mapping하고 보니

위 그림 a와 같이 low mapping quality를 갖는 window가 보이더라(내가 이해하기론 Maqs의 mapping quality가 10 이상인 read mapping 만 이용했는데, genome을 50 kb로 window를 만들어서 각 window별로 read에 의해 얼마나 커버 됐는지에 따라 frequency를  그림으로 표현했을때). 이런 것이 알고 보니 duplication/structural variation이더라. 그래서 이런 부분은 mask 하고 분석했다. 두번째 그림은 read 양별로 얼마나 methylation 부위를 커버하는지. 보면 특정 read 수가 넘어가면 뭐 cover 하는 양이 크게 변화가 없는걸로 보인다.

BATMAN으로 MeDIP-Seq을 분석할려면 두가지에서 변형이 필요한다. 1.linear 모델대신 2차의 polynomial model 사용.2.Gaussian error model 대신 rectified Gaussian model 사용. 100bp resolution으로 결과를 뽑아 냈단다. 그리고 repeat이 있는 부위의 methylation은 under-estimate 될거란 생각에 버린다.

Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology

intro에서는 DNA methylation 실험 방법 종류 설명. MeDIP이랑 MBD¹. MeDIP의 경우 antibody를 이용하고 MBD는 Methyl-Binding Domain protein인 MECP2²를 사용. 논문에 따르면 MBD-seq은 MeDIP-seq 보다는 최근에 시작 됐다고 하네. 그담에 BS-Seq에 대한 이야기가 나온다. 아직(그러니까 그당시 2010 4월) 까진 whole genome BS-Seq이 Arabidopsis 랑 human의  밖에 없단다.
아.. 이 논문 YH(Yan Huang) methylome project 의 시작 논문인갑다(관련 기사). 이게 PBMCs(peripheral blood mononuclear cells) 의 methylome을 base resolution으로다가 밝히는 작업인데.. 이미 YH project에서 genome 을 sequencing 했기에 bisulfite 처리된 read를 mapping 할 때 자신의 genome sequence에다가 mapping 하기 때문에 accuracy가 높다. 또한 ASM(allele specific methylome)이 ASE(allele specific expression)이랑 연관이 깊더라 이런 점도 밝혔단다.


여튼 이 논문의 목적이 뭐냐. 이 논문이 publish 됐을 때 BS-Seq 데이터는 이미 plos biology에 논문이 나갈 준비가 되고 있었던거 같고(in press라고 표현 된걸로 보아), 이 논문에서는 그 BS-Seq 데이터를 reference로 해서 MeDIP-Seq과 MBD-Seq을 비교해 본다.


결론을 이야기 하자면 일단 여기는 프로그램을 MACS을 써서 methylated region을 찾았는데, MBD-Seq은 highly methylated, high-CpG density region에 sensitive 하고 MeDIP은 highly methylated, intermediated-CpG density regions에 sensitive 하다는 것. 아... 그런데 결정적인 말이 있다. BS-Seq 분석결과 대부분의 highly methylated regulatory region은 low-CpG density 이므로 이런거 분석 할려면 MeDIP이 났단다. 아 근데.. 뭐지.. 실험적인 측면에서 이야기 한게 있는데 NaCl 농도를 600mM 로 하면 MBD-Seq도 low-CpG에 sensitive 하단다(salt 농도에 따른 protein의 활성에 따른건가? 이건.. 자세히 봐야 알겠다). 
아래 그림이 두 방법을 비교한 그림

그리고 두 방법 다 read density가 methylation 정도를 정확히 표한하진 못했다고.. 이 사실은 이미 알려져 있었던거고 CpG density에 read density와 correlation이 있다는것. 그래서 CpG density에 연관된 biased를 교정하는 step이 절대적으로 필요하단다. MBD-Seq의 경우 high- MeDIP의 경우 intermediate- CpG density에 대한 교정이 필요. 이 교정 방법으로 소개한게 Bayesian strategy(이 논문 꼭 봐야 겠다). 


결론은 두 방법을 섞어서 사용하는게 좋을거 같다는거고 그래도 BS-Seq을 대체하지 못하고 특히나 bias 때문에 absolute 한 값을 사용하는건 좋은 생각이 아니라는 것. 다만 두 sample을 비교 할때는 어짜피 둘다 bias가 들어가 있으니 relative 한 값을 비교할때는 괜찮을 것이라는 것.

------------------------reference-----------------------------
1.MBD-Seq :
2.MECP2 :
2.BS-Seq :

Special Online Collection: Epigenetics

예전에 영건씨가 카페에 올린 science지에 epigenetic special 이다. 사이트는 여기.